Com es taca Gram (amb imatges)

Taula de continguts:

Com es taca Gram (amb imatges)
Com es taca Gram (amb imatges)

Vídeo: Com es taca Gram (amb imatges)

Vídeo: Com es taca Gram (amb imatges)
Vídeo: ПРОСТОЕ БЛЮДО‼ ПОДОЙДЁТ К МЯСУ РЫБЕ. ХРЕНОВИНА. КОМЕДИЯ 2024, Març
Anonim

La tinció de Gram és un procediment ràpid que s’utilitza per buscar la presència de bacteris en mostres de teixits i per caracteritzar els bacteris com a Gram-positius o Gram-negatius, basant-se en les propietats químiques i físiques de les seves parets cel·lulars. La tinció de Gram quasi sempre s’ha de fer com a primer pas en el diagnòstic d’una infecció bacteriana.

La taca de Gram rep el nom del científic danès Hans Christian Gram (1853 - 1938), que va desenvolupar la tècnica el 1882 i la va publicar el 1884 com a tècnica per discriminar dos tipus de bacteris amb símptomes clínics similars: Streptococcus pneumoniae (també conegut com el pneumococ) i els bacteris Klebsiella pneumoniae.

Passos

Primera part de 3: Preparació d’una tinció de Gram

Gram Stain Pas 1
Gram Stain Pas 1

Pas 1. Prepareu-vos per al treball de laboratori

Poseu-vos guants i lligueu-vos els cabells llargs per evitar la contaminació de la mostra de bacteris que provareu. Desinfecteu un espai de treball sota la campana de fum, o en una altra zona ben ventilada. Comproveu que el cremador Bunsen i el microscopi funcionin abans de començar.

Gram Stain Pas 2
Gram Stain Pas 2

Pas 2. Esterilitzeu una làmina de microscopi de vidre

Si el portaobjectes de vidre està brut, renteu-lo amb aigua sabonosa per eliminar el greix i la brutícia. Desinfecteu el portaobjectes amb etanol, un netejador de vidres o qualsevol mètode recomanat pel vostre laboratori.

Gram Stain Pas 3
Gram Stain Pas 3

Pas 3. Afegiu la mostra a la diapositiva

Podeu utilitzar el mètode de tinció de Gram per identificar els bacteris presents en mostres mèdiques o els cultius bacterians que es conreen en una placa de Petri. Per tal que la taca de Gram sigui útil, afegiu un prim capa de la mostra sobre la taca. Es recomana una mostra de menys de 24 hores, ja que els bacteris més antics poden haver danyat les parets cel·lulars que responen menys de manera previsible a la tinció de gram.

  • Si utilitzeu una mostra de teixit, afegiu 1-2 gotes al portaobjectes. Esteneu-lo uniformement sobre el portaobjectes per formar una prima frotis, utilitzant la vora d’un segon portaobjectes de vidre esterilitzat. Deixeu-ho assecar a l'aire abans de continuar.
  • Si treieu bacteris d'una placa de Petri, esterilitzeu un bucle d'inoculació en una flama del cremador Bunsen fins que brille i deixeu-lo refredar. Utilitzeu-lo per col·locar una gota d’aigua estèril al portaobjectes i, a continuació, esterilitzeu i refredi el bucle abans de transferir una petita mostra de bacteris i remenar-lo suaument a l’aigua.
  • Els bacteris del brou s’han de barrejar en un remolí, després s’han d’afegir amb un bucle d’inoculació com s’ha indicat anteriorment, sense afegir aigua addicional.
  • Si teniu una mostra de hisop, feu passar el hisop lleugerament per la diapositiva.
Gram Stain Pas 4
Gram Stain Pas 4

Pas 4. Fixeu el frot de calor

La calor fixarà els bacteris a la diapositiva, de manera que no s’esbandiran tan fàcilment durant la taca. Passeu ràpidament la diapositiva dues o tres vegades per una flama del cremador Bunsen o escalfeu-la a sobre d’un escalfador elèctric. No escalfeu en excés perquè les mostres es puguin distorsionar. Si utilitzeu un cremador Bunsen, la flama ha de ser un con petit de color blau i no de color taronja alt.

Com a alternativa, el frotis es pot fixar mitjançant metanol, afegint 1-2 gotes de metanol al frotis sec, drenant l'excés de metanol i deixant-lo assecar a l'aire. Aquest mètode minimitza el dany a les cèl·lules hostes i proporciona un fons més net

Gram Stain Pas 5
Gram Stain Pas 5

Pas 5. Col·loqueu la diapositiva sobre una safata de taques

Una safata de taca és un plat de metall, vidre o plàstic poc profund amb una malla petita o un suport de filferro que travessa la part superior. Col·loqueu la diapositiva sobre aquest suport perquè els líquids que utilitzeu puguin escórrer cap a la safata.

Si no teniu cap tauleta, la diapositiva es pot col·locar directament a sobre d’una safata de plàstic

Part 2 de 3: Realització de la tinció de Gram

Gram Stain Pas 6
Gram Stain Pas 6

Pas 1. Inundar el frotis amb violeta de vidre

Utilitzeu una pipeta per inundar la mostra de bacteris amb diverses gotes de colorant violeta cristal·lí, de vegades anomenat violeta genciana. Espereu de trenta a seixanta segons. El violeta cristal·lí (CV) es dissocia en solucions aquoses en ions CV + i clorur (Cl–). Aquests ions penetren a través de la paret cel·lular i la membrana cel·lular de les cèl·lules tant gram-positives com gram-negatives. L’ió CV + interactua amb components carregats negativament de cèl·lules bacterianes per tacar les cèl·lules de color porpra.

Molts laboratoris utilitzen el cristall violeta "Hucker", que afegeix oxalat d'amoni per evitar la precipitació

Gram Stain Pas 7
Gram Stain Pas 7

Pas 2. Esbandiu el cristall violeta suaument

Inclineu la diapositiva i utilitzeu una ampolla de rentat per escampar un petit raig d’aigua destil·lada o de l’aixeta sobre la part superior de la diapositiva. L’aigua hauria de baixar sobre la superfície del frotis, però no dirigir-s’hi directament. No esbandiu excessivament, cosa que podria eliminar la taca dels bacteris Gram positius.

Gram Stain Pas 8
Gram Stain Pas 8

Pas 3. Inundar el frotis amb iode i després esbandir

Utilitzeu una pipeta per cobrir el frotis amb iode. Deixeu-lo reposar durant 60 segons com a mínim i, a continuació, esbandiu-lo amb el mateix mètode acurat. El iode, en forma d’ions amb càrrega negativa, interactua amb CV + per formar grans complexos de cristall violeta i iode (complexos CV – I) dins de les capes internes i externes de la cèl·lula. Això atraparà el color violeta cristall porpra a la cel·la, allà on s’hagi tacat.

El iode és corrosiu. Eviteu la inhalació, la ingestió o el contacte amb la pell

Gram Stain Pas 9
Gram Stain Pas 9

Pas 4. Afegiu un descolorant i esbandiu ràpidament

Normalment s’utilitza una barreja 1: 1 d’acetona i etanol per a aquest pas crític, que s’ha de cronometrar amb cura. Mantingueu el portaobjectes inclinat i, a continuació, afegiu el descoloritzant fins que no quedi més color violeta a l'escorrentia de drenatge. Normalment triga menys de 10 segons, o fins i tot menys temps si el decolorant conté concentracions més altes d’acetona. Atureu-vos immediatament o el descoloritzant eliminarà la taca violeta de cristall tant de les cèl·lules gram-positives com de les negatives i caldrà repetir la taca. Esbandiu immediatament l'excés de descolorant, utilitzant la tècnica anterior.

  • En el seu lloc es pot utilitzar acetona pura (95% +). Com més acetona hi hagi, més ràpid funcionarà el descoloridor, que requereix un temps més precís.
  • Si teniu problemes per sincronitzar aquest pas, penseu a afegir el descoloritzant gota a gota.
Gram Stain Pas 10
Gram Stain Pas 10

Pas 5. Inundar el frotis amb taca antitabac i després esbandir

Es fa servir un contra-taca, típicament safranina o fucsina, per afegir un contrast extra entre bacteris gram negatius i gram positius, tenyint els bacteris decolorats (gram negatius) de color rosa o vermell. Deixeu-ho durant 45 segons com a mínim i, a continuació, esbandiu-lo.

Fuchsin tacarà molts bacteris gram negatius de manera més intensa, com ara haemophilus spp i legionella spp. Això pot fer que sigui una millor opció per a principiants

Gram Stain Pas 11
Gram Stain Pas 11

Pas 6. Assecar la diapositiva

Podeu permetre que la diapositiva s'assequi a l'aire o que s'assequi amb paper bibulós venut amb aquest propòsit. La taca de Gram està completa.

Part 3 de 3: Examen del resultat

Gram Stain Pas 12
Gram Stain Pas 12

Pas 1. Prepareu el microscopi òptic

Col·loqueu la diapositiva sota el microscopi òptic. Els bacteris varien molt en mida, de manera que l’augment total requerit variarà de 400x a 1000x. A l’extrem superior d’aquests augments, es recomana un objectiu d’immersió d’oli per obtenir una major claredat. Col·loqueu una gota d'oli d'immersió a la diapositiva, evitant el moviment durant l'aplicació per evitar bombolles. Mou la torreta del microscopi perquè l’objectiu de l’objectiu quedi al seu lloc i toqui l’oli.

La immersió en oli només es pot utilitzar en objectius dissenyats especialment, no en objectius "secs"

Gram Stain Pas 13
Gram Stain Pas 13

Pas 2. Identifiqueu els bacteris gram-positius i gram-negatius

Examineu la diapositiva al microscopi òptic. Els bacteris gram positius apareixen de color porpra, a causa del violeta cristal·lí atrapat dins de les seves gruixudes parets cel·lulars. Els bacteris gramnegatius apareixen de color rosa o vermell, ja que el violeta es va rentar a través de les fines parets cel·lulars i després hi va entrar la contra taca rosa.

  • Si la mostra és massa gruixuda, és possible que obtingueu resultats falsos positius. Tinteu una nova mostra si tots els tipus de bacteris són gram-positius, per assegurar-vos que el resultat sigui correcte.
  • Si el descoloridor ha funcionat massa temps, és possible que obtingueu resultats falsos negatius. Tinteu una nova mostra si tots els tipus de bacteris són gramnegatius, per comprovar de nou els resultats.
Gram Stain Pas 14
Gram Stain Pas 14

Pas 3. Cerqueu imatges de referència

Si no esteu segur de què és un bacteri, busqueu una col·lecció d'imatges de referència, ordenades per forma i resultat de la taca de gram. Podeu trobar bases de dades en línia a la Base de dades nacional de patògens microbians i a molts altres llocs. Per facilitar la identificació, a continuació s’ordenen exemples comuns o importants per al diagnòstic per estat i forma de gram.

Gram Stain Pas 15
Gram Stain Pas 15

Pas 4. Identifiqueu els bacteris gram-positius per forma

Els bacteris també es classifiquen per la seva forma al microscopi, més comunament com a cocs (esfèrics) o varetes (cilíndriques). A continuació, es mostren alguns bacteris gram-positius (tenyits de porpra) comuns organitzats per formes:

  • Cocs gram-positius generalment són estafilococs (que signifiquen cocs en grups) o estreptococs (que significa cocs en cadenes).
  • Varetes gram-positives inclouen Bacillus, Clostridium, Corynebacterium i Listeria. Actinomyces spp. les barres solen tenir branques o filaments.
Gram Stain Pas 16
Gram Stain Pas 16

Pas 5. Identifiqueu els bacteris gramnegatius

Els bacteris gram negatius (tenyits de rosa) sovint es classifiquen en tres grups. Els cocos són bacteris esfèrics, les varetes són bacteris llargs i prims i les barres de coccoide es troben en algun lloc intermedi.

  • Cocs gramnegatius són més freqüentment Neisseria spp.
  • Varetes gramnegatives inclouen E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas i molts altres. Vibrio cholerae pot aparèixer com a varetes ordinàries o varetes corbes.
  • Varetes "coccoides" gramnegatives (o "coccobacils") inclouen Bordetella, Brucella, Haemophilus i Pasteurella.
Gram Stain Pas 17
Gram Stain Pas 17

Pas 6. Avaluar resultats mixtos

Alguns bacteris són difícils de tacar amb precisió, a causa de la fragilitat o la cera de les seves parets cel·lulars. Poden tenir una barreja de taca porpra o rosa a la mateixa cèl·lula o entre cèl·lules diferents en el mateix frotis. Qualsevol mostra de bacteris de més de 24 hores pot tenir aquest problema, però algunes espècies són difícils de tacar a qualsevol edat. Poden requerir proves més especialitzades per restringir la identificació, com ara una taca àcida ràpida, observació del creixement de cultius, cultius mitjans TSI o proves genètiques.

  • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Propionibacterium spp. tots es consideren bacteris gram-positius, però sovint apareixen tenyits inconclusivament.
  • Bactèries petites i primes com ara Treponema, Chlamydia i Rickettsia spp. són difícils de tacar correctament.
Gram Stain Pas 18
Gram Stain Pas 18

Pas 7. Eliminar els materials

Els procediments d’eliminació de residus varien entre laboratoris i segons els materials que s’utilitzin. Normalment, el líquid de la safata de taca s’elimina en ampolles segellades com a residus perillosos. Remull les diapositives en una solució de lleixiu al 10% i, a continuació, llenceu-les en contenidors per a objectes punxants.

Consells

  • Recordeu que el rendiment de la tinció de Gram només és tan bo com l’espècimen. És important ensenyar als pacients a proporcionar bones mostres (per exemple, la diferència entre un espit versus una tos profunda per a mostres d’espector).
  • Com a decolorant, l’etanol actua més lentament que l’acetona.
  • Seguiu les precaucions estàndard de laboratori.
  • Utilitzeu un hisop de galta per a la pràctica, ja que la mostra ha de contenir tant bacteris gram-positius com gram-negatius. Si només veieu un tipus o un altre, és probable que utilitzeu massa o massa descoloritzants.
  • Podeu utilitzar una pinça de roba de fusta tipus molla per agafar la diapositiva.

Advertiments

  • L’acetona i l’etanol són inflamables. L’acetona eliminarà els olis de les mans i farà que la pell absorbeixi altres productes químics amb més facilitat. Utilitzeu guants i utilitzeu-los amb precaució.
  • No deixeu que el frotis s’assequi abans d’esbandir la taca o el contra-taca.

Recomanat: